O que é a Cromatografia Líquida?

Existem dois tipos de cromatografia: a cromatografia em fase gasosa, que separa os componentes voláteis de uma amostra, e a cromatografia líquida/líquida, que separa as moléculas neutras de pequena dimensão em solução. Das duas opções de separação, a cromatografia em fase líquida (LC) é o método mais frequentemente utilizado.

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O funcionamento da cromatografia líquida

O processo de cromatografia líquida é um tipo de cromatografia muito utilizado para separar moléculas de uma amostra (soluto). Esta amostra é diluída num solvente a que se chama fase móvel. A separação ocorre com base nas interações moleculares entre as suas próprias moléculas e a fase estacionária (substrato).
A cromatografia líquida utiliza a permeação com gel ou a permuta iónica. A permeação com gel consiste em separar as moléculas de acordo com o seu tamanho e o método de permuta iónica consiste em separar as partículas de acordo com a sua carga.
A separação pode ser efetuada numa coluna ou numa folha, ou seja sobre uma folha com fase móvel líquida e um suporte sólido como fase estacionária. Os revestimentos internos da coluna podem ser muito diferentes, dependendo do que vai ser analisado, devido às interações componente-amostra.
A fase móvel desloca-se ao longo da fase estacionária, transportando consigo os componentes da amostra separados durante a cromatografia. Em CL, a interação entre as moléculas da amostra e o meio cromatográfico é influenciada por vários fatores, como o tamanho, a carga, a ligação por afinidade, a adsorção ou a hidrofobicidade.
A cromatografia líquida é utilizada para separar (separação molecular) compostos solúveis que são pouco sensíveis ao calor (proteínas, etc.). Assim, as suas principais aplicações são nos laboratórios farmacêuticos e de investigação.

Tipos de cromatografia líquida

Existem vários tipos de cromatografia líquida:

Cromatografia líquida - CL.
Cromatografia líquida com detetor de espectrometria de massa - CL/SM
Supercrítico: este método utiliza as propriedades do CO2 que, sob determinadas condições de pressão e temperatura (> 31 °C e > 73 bar), se torna um solvente.

Formas avançadas de CL

A cromatografia líquida de elevado desempenho ou a cromatografia líquida de alta pressão (CLHP ou HPLC) é uma forma avançada de CL. Utiliza alta pressão (20-150 bar) para forçar a amostra através da coluna, aumentando assim a velocidade, baixando o limiar de deteção e melhorando a fiabilidade e a precisão. É atualmente o método de análise quantitativa mais utilizado nos laboratórios de análise e na indústria farmacêutica.

CL-SM, fiabilidade e polivalência

A cromatografia em fase líquida acoplada a detetores de espectrometria de massa é um método de análise química que combina duas tecnologias. Proporciona polivalência (deteção de uma gama mais vasta de moléculas) e eficiência (por exemplo, moléculas muito complexas) para identificar e/ou quantificar com precisão muitas substâncias. Esta tecnologia, inicialmente dispendiosa, está a tornar-se mais acessível e em constante desenvolvimento.

Cromatografia supercrítica sem solventes químicos

Esta técnica utiliza CO2 como solvente, um gás que se torna solvente a temperaturas superiores a 31 °C e a uma pressão de 73 bar. A cromatografia líquida com CO2 oferece todas as vantagens de um solvente convencional, ao mesmo tempo que é mais amiga do ambiente. A amostra é diluída na fase líquida e rapidamente disponibilizada na fase gasosa para uma maior eficiência. Ao contrário de um solvente convencional, não é necessária a etapa adicional de eliminação do solvente por purga de azoto.

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Diferença entre cromatografias em fase gasosa e líquida

Como o nome indica, e ao contrário da cromatografia em fase gasosa, a cromatografia líquida utiliza uma fase móvel líquida como suporte. Os líquidos são normalmente misturas de solventes de polaridades compatíveis, enquanto na cromatografia gasosa a fase móvel é um único gás de elevada pureza.

Cromatografia supercrítica sem solventes químicos

Existem muitas outras características que diferenciam estes dois métodos. Verifique na tabela a seguir:

Cromatografia líquida	Cromatografia em fase gasosa
A fase móvel é um líquido.	A fase móvel é um gás.
A separação baseia-se na interação do soluto com o meio cromatográfico.	A separação baseia-se principalmente nos pontos de ebulição das moléculas de soluto.
Utilizada para separar qualquer composto solúvel, por exemplo, aminoácidos, proteínas, medicamentos, ácidos nucleicos, lípidos, antioxidantes, glúcidos e polímeros naturais e artificiais.	Aplicada à separação de compostos voláteis e misturas gasosas.
Normalmente efetuada à emperatura ambiente, esta técnica permite a análise segura de compostos sensíveis ao calor.	Quando efetuada a temperaturas mais elevadas, s substâncias termicamente sensíveis podem ser desnaturadas.
Trata-se de uma técnica relativamente lenta.	A análise é mais rápida e é normalmente medida em poucos minutos, se bem que possa demorar apenas alguns segundos.
Utiliza solventes líquidos polares , como a água ou o metanol. moléculas com polaridades diferentes nos seus componentes	Utiliza qualquer solvente que se evapore.

Gases para cromatografia

Gases nestas tecnologias

No caso da LC-MS ou CLHP-MS, o detetor MSL, quando utilizado, requer um fluxo de azoto para remover eficazmente o solvente da amostra antes da etapa de identificação e quantificação no núcleo do detetor. É importante referir que visto que um LC-MS consome normalmente 10 m3/dia, o equivalente a uma garrafa de 50 litros, existem várias opções disponíveis para o laboratório, dependendo do número de LC-MSS e da sua taxa de utilização:

Garrafas ou quadros com central de inversão.
Recipiente líquido com evaporador.
Gerador de azoto nas instalações.
Esta solução é possível dada a qualidade do azoto exigida pelo fabricante do analisador (cerca de N30, ou seja, uma pureza de 99,9%). A utilização de um gerador de azoto é comum e confortável.Este equipamento requer manutenção e, por esta razão, é fortemente recomendado prever uma solução de reserva com garrafas e um sistema de rede de gás.

A cromatografia líquida supercrítica utiliza CO2 (qualidade Alphagaz SFC - 99,998% de composição) fornecido sob forma líquida em vários formatos: